Ami de John Lennon, qu'il rencontre à l'école d'Art de Liverpool, il rejoint les Beatles en janvier 1960, à la guitare basse. Stuart n'est pas réellement musicien et il ne se joint au groupe que parce qu'il a les moyens de s'acheter une basse (grâce à la vente de l'un de ses tableaux). En concert, il se produit dos au public pour que personne ne s'aperçoive qu'il ne sait pas jouer. Il arrive aussi que son instrument ne soit carrément pas branché à un ampli, comme le raconte Sam Leach, organisateur de concerts à Liverpool au début des années 1960, dans son livre Les Beatles avant la gloire1. Sutcliffe participe notamment à la tournée pendant laquelle les Beatles accompagnent Johnny Gentle.
Sur les premières photos du groupe à Hambourg (photos prises par Astrid Kirchherr), on est frappé par sa beauté, et son côté James Dean. En août 1960, alors que les Beatles sont engagés à Hambourg par Bruno Koschmider (en), Stuart rencontre Astrid et en tombe follement amoureux (dans l'une des lettres qu'il adresse à sa mère, il dit en parlant d'Astrid « Dieu que je l'aime »). Une rumeur raconte d'ailleurs qu'Astrid serait à l'origine de la coupe des Beatles. Ce bruit fut démenti par Paul McCartney qui rencontra un jeune styliste allemand à Paris. Sa coupe de cheveux étant très « stylée », Paul et John demandèrent la même.
Il quitte le groupe au printemps 1961 pour se consacrer à ses études d'art, mais surtout pour rester auprès de la femme qu'il aime, Astrid Kirrscher, qui réside à Hambourg. C'est désormais Paul McCartney qui joue de la basse, Lennon et Harrison ne voulant pas quitter leur guitare.
Le 10 avril 1962, à Hambourg où il habite, Stuart Sutcliffe meurt d'une hémorragie cérébrale, trois jours avant le retour des Beatles en Allemagne. Il n'avait que 21 ans. John Lennon est très marqué par cette disparition et y fera allusion dans plusieurs chansons notamment In My Life (sur l'album Rubber Soul en 1965).
Les toiles de Stuart Sutcliffe sont reconnues comme excellentes par de nombreux experts et se vendent très bien aujourd'hui encore.
Un film a été consacré à Stuart Sutcliffe, Backbeat, réalisé par Iain Softley, interprété par Stephen Dorff, sorti en 1994.
